Mfn1/Mitofusin 1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400637-ACT

Das humane MFN1-Gen kodiert Mitofusin 1 (Mfn1), eine dynaminähnliche GTPase, die in der äußeren Mitochondrienmembran verankert ist und die mitochondriale Fusion vermittelt sowie die Architektur des mitochondrialen Netzwerks formt. Mfn1 wirkt zusammen mit MFN2 und OPA1, um die Organisation der Cristae, die Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA und die bioenergetische Effizienz zu regulieren, und verknüpft so das Gleichgewicht zwischen Fusion und Spaltung mit Signalwegen der Mitophagie und Apoptose. Durch die Kontrolle von Konnektivität und Verteilung der Organellen beeinflusst MFN1 den zellulären Stoffwechsel und Stressantworten in Pfaden, die mit oxidativer Phosphorylierung und der Homöostase reaktiver Sauerstoffspezies verbunden sind. Eine Fehlregulation der mitochondrialen Dynamik unter Beteiligung von MFN1 wurde mit Neurodegeneration, Kardiomyozyten-Dysfunktion und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Studien zur mitochondrialen Qualitätskontrolle und zu Krankheitsmechanismen unterstreicht.

Mfn1/Mitofusin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MFN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Mfn1/Mitofusin 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MFN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MFN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Mfn1/Mitofusin 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MFN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Mfn1/Mitofusin 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Mfn1/Mitofusin 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MFN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.