Metallothionein 3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403201-ACT

Das humane MT3-Gen kodiert Metallothionein 3, ein cysteinreiches, metallbindendes Protein, das die intrazelluläre Verfügbarkeit von Zink und Kupfer reguliert und über eine thiolbasierte Abfangreaktion reaktiver Sauerstoffspezies zur Redox-Pufferung beiträgt. MT3 beeinflusst metallabhängige Signalwege, die antioxidative Abwehr und die Proteostase und verknüpft zelluläre Stressantworten mit Transkriptionsprogrammen, die durch metallresponsive Elemente sowie Signalwege des oxidativen Stresses gesteuert werden. Im Nervensystem wird es mit neuronaler Differenzierung, synaptischer Funktion und Resistenz gegenüber metallinduzierter Toxizität in Verbindung gebracht; zudem wurde eine veränderte MT3-Expression in neurodegenerativen und neuroinflammatorischen Zusammenhängen beschrieben. Eine gestörte Metallhomöostase und oxidative Schäden im Kontext der MT3-Biologie sind auch für Modelle des Krebszellstoffwechsels und der Stressadaptation relevant.

Metallothionein 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Metallothionein 3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Metallothionein 3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Metallothionein 3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Metallothionein 3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.