Metallothionein 2A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410889-ACT

MT2A kodiert Metallothionein 2A, ein cysteinreiches, metallbindendes Protein, das intrazelluläres Zink und Kupfer puffert, toxische Schwermetalle wie Cadmium sequestriert und zur Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase beiträgt. Durch die Regulation der Metallverfügbarkeit beeinflusst MT2A metallabhängige Transkriptionsprogramme und antioxidative Antworten und greift dabei in Stresssignalwege sowie Entgiftungsprozesse ein. Die Expression von MT2A ist durch oxidativen Stress, inflammatorische Signale und Metallbelastung induzierbar, was es mit Signalwegen verknüpft, die das Zellüberleben und die Anpassung an Umwelteinflüsse steuern. Eine dysregulierte Metallothionein-Biologie wurde mit Veränderungen im Metallstoffwechsel und in der Stresstoleranz in verschiedenen Krebsarten, in neurodegenerativen Kontexten und in Modellen von Leberschädigungen in Verbindung gebracht, wodurch MT2A ein nützlicher Ansatzpunkt für mechanistische Studien metallresponsiver Signalwege ist.

Metallothionein 2A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MT2A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Metallothionein 2A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MT2A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MT2A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Metallothionein 2A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MT2A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Metallothionein 2A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Metallothionein 2A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MT2A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.