Metallothionein 1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410887-ACT

MT1A kodiert Metallothionein 1A, ein cysteinreiches, metallbindendes Protein, das intrazelluläres Zink und Kupfer puffert und toxische Schwermetalle wie Cadmium und Quecksilber sequestriert. Durch die Regulierung der Metallhomöostase und des zellulären Redoxgleichgewichts beeinflusst MT1A oxidative Stressantworten, Entgiftungsprogramme und Signalwege, die von der Zinkverfügbarkeit abhängen, einschließlich der Aktivität von Transkriptionsfaktoren und stressinduzierbarer Gennetzwerke. Die MT1A-Expression reagiert auf Metallbelastung, entzündliche Signale und zellulären Stress; eine veränderte Regulation von Metallothioneinen wurde mit einer erhöhten Anfälligkeit für Metalltoxizität, Gewebeschädigungen und weiteren pathophysiologischen Prozessen im Zusammenhang mit oxidativen Schäden in Verbindung gebracht. Diese Eigenschaften machen MT1A zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung metallabhängiger Proteostase, Stressanpassung sowie der Wechselwirkungen zwischen Entgiftung und inflammatorischer Signalgebung.

Metallothionein 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MT1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Metallothionein 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MT1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MT1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Metallothionein 1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MT1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Metallothionein 1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Metallothionein 1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MT1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.