Met CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400101-ACT

MET kodiert die humane Rezeptor-Tyrosinkinase Met, den wichtigsten Signalrezeptor für den Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF). Die ligandabhängige Aktivierung von Met löst eine Autophosphorylierung aus und leitet nachgeschaltete Signalkaskaden ein, darunter PI3K–AKT, RAS–MAPK, STAT sowie SRC/FAK. Dadurch werden Programme für Proliferation, Überleben, Motilität und epithelial-mesenchymale Transition koordiniert. Eine Fehlregulation des MET-Signalwegs durch Überexpression, Amplifikation, aktivierende Mutationen oder aberrante autokrine Signalgebung wird in der Onkologie und Entwicklungsbiologie häufig untersucht, da sie mit invasivem Wachstum, metastatischer Kompetenz und Geweberegeneration in Zusammenhang steht.

Met Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MET-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Met Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MET-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MET-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Met-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MET-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Met-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Met-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MET-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.