melanopsin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402783-ACT

Das humane OPN4 kodiert Melanopsin, ein retinales Opsin und G‑Protein‑gekoppeltes Photopigment, das vor allem dafür bekannt ist, die intrinsische Photosensitivität in spezialisierten retinalen Ganglienzellen zu vermitteln. Nach Lichtaktivierung koppelt Melanopsin primär an die Gq/11‑Signalübertragung, stimuliert PLCβ, erhöht die intrazelluläre Calciumkonzentration und moduliert nachgeschaltete Signalwege, die die neuronale Erregbarkeit und Transkriptionsprogramme beeinflussen. Diese Phototransduktionsachse trägt zu nicht bildgebenden visuellen Funktionen bei, darunter die zirkadiane Photoentrainment und die Regulation des Pupillenlichtreflexes, und verknüpft die OPN4‑Aktivität mit der Schlaf‑Wach‑Taktung sowie neuroendokrinen Rhythmen. Veränderte Melanopsin‑Signalgebung wurde im Zusammenhang mit zirkadianer Dysregulation und lichtabhängigen physiologischen Reaktionen untersucht, die für die neurobehaviorale und retinale Forschung relevant sind.

melanopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen OPN4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

melanopsin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des OPN4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der OPN4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen melanopsin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native OPN4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von melanopsin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des melanopsin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem OPN4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.