Plasmide CRISPR d'Activation (h) MEL-1A-R: sc-401075-ACT

MTNR1A code le récepteur de la mélatonine 1A (MEL-1A-R), un RCPG couplé à Gi/o qui médiatise les réponses cellulaires à la mélatonine dans des tissus à la fois centraux et périphériques. L’activation du récepteur supprime généralement l’activité de l’adénylate cyclase, module la signalisation cAMP/PKA et peut influencer les voies MAPK/ERK et celles liées à PI3K, façonnant des programmes transcriptionnels qui coordonnent le timing circadien et la régulation neuroendocrinienne. La signalisation de MTNR1A contribue au contrôle des rythmes veille–sommeil, au fonctionnement de l’axe reproducteur et à l’homéostasie métabolique ; des altérations de l’expression ou de la signalisation du récepteur sont associées à des phénotypes de désalignement circadien et sont étudiées dans des contextes de recherche sur des maladies neuropsychiatriques et métaboliques connexes. En tant que récepteur membranaire présentant des sorties de signalisation dépendantes du ligand bien définies, MTNR1A est fréquemment utilisé pour disséquer le couplage des voies des RCPG, la désensibilisation et l’internalisation des récepteurs, ainsi que les réseaux de gènes contrôlés par l’horloge.

MEL-1A-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTNR1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MEL-1A-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTNR1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTNR1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MEL-1A-R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTNR1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MEL-1A-R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MEL-1A-R dans les cellules tumorales présentant une expression de MTNR1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.