MEK-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400397-ACT

MAP2K1 kodiert MEK-1, eine dualspezifische Kinase, die ERK1/2 innerhalb der kanonischen RAS–RAF–MEK–ERK-MAPK-Kaskade phosphoryliert und aktiviert. MEK-1 integriert Signale von Rezeptor-Tyrosinkinasen und GTPasen der RAS-Familie, um Proliferation, Differenzierung, Überleben und stimulusabhängige Transkriptionsprogramme zu regulieren. Eine strenge Kontrolle von Aktivität und Expression von MEK-1 ist entscheidend für einen angemessenen Zellzyklusverlauf und die Rückkopplungsregulation innerhalb von MAPK-Signalnetzwerken. Eine Fehlregulation der MAP2K1/MEK-1-Signalgebung wird häufig im Kontext onkogener Aktivierung des MAPK-Signalwegs, von Entwicklungsstörungen und von Mechanismen erworbener Signalweg-Umverdrahtung untersucht.

MEK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAP2K1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MEK-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAP2K1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAP2K1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MEK-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAP2K1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MEK-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MEK-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAP2K1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.