Plasmide CRISPR d'Activation (h) ME1: sc-401587-ACT

Le gène humain **ME1** code l’enzyme malique cytosolique 1 dépendante du **NADP**, qui catalyse la conversion du malate en pyruvate tout en générant du **NADPH** nécessaire à la biosynthèse réductrice et à la défense antioxydante. En fournissant du NADPH, ME1 soutient la synthèse des acides gras et du cholestérol, maintient l’équilibre rédox via le recyclage du glutathion et relie des intermédiaires de la glycolyse et du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs) au métabolisme anabolique. L’activité de ME1 s’inscrit au carrefour du métabolisme central du carbone et de voies dépendantes du NADPH qui influencent la prolifération cellulaire, les réponses au stress oxydant et les programmes de différenciation. Des modifications de l’expression de ME1 ont été associées à des remaniements métaboliques observés dans divers contextes liés aux maladies, notamment le métabolisme tumoral, la résistance à l’insuline et la dérégulation lipidique, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques.

ME1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ME1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ME1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ME1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ME1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ME1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ME1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ME1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ME1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ME1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.