MDR3/ABCB4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404167-ACT

ABCB4 (MDR3) kodiert einen ATP-Binding-Cassette-Transporter, der in der kanalikulären Membran von Hepatozyten lokalisiert ist und dort die ATP-abhängige Translokation von Phosphatidylcholin in die Galle vermittelt. Dieser Lipidtransportprozess unterstützt die Gallebildung und trägt durch die Modulation der Gallenzusammensetzung zur Aufrechterhaltung der Integrität der Gallenwegs-/Kanalikulusmembran bei; dabei greift er in die hepatische Lipidhomöostase sowie in Signal- und Transportwege des Membranverkehrs ein. Eine dysregulierte MDR3/ABCB4-Aktivität verändert das biliäre Phospholipidgleichgewicht und ist mit cholestatischen Leberphänotypen und hepatobiliären Schädigungen assoziiert. Daher wird ABCB4 in Modellen zur Kopplung von Gallensäuren und Phospholipiden, zur Hepatozytenpolarität und zur Regulation von Transportern in der Leberphysiologie breit untersucht.

MDR3/ABCB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ABCB4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MDR3/ABCB4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ABCB4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ABCB4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MDR3/ABCB4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ABCB4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MDR3/ABCB4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MDR3/ABCB4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ABCB4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.