Plasmide CRISPR d'Activation (h) MDC1: sc-405652-ACT

Mediator of DNA Damage Checkpoint 1 (MDC1) est une protéine d’échafaudage nucléaire qui amplifie la signalisation des cassures double brin de l’ADN en se liant à H2AX phosphorylée (γH2AX) et en coordonnant le recrutement des facteurs de réparation et de contrôle. Grâce à des interactions qui soutiennent une signalisation dépendante d’ATM, MDC1 favorise l’activation des points de contrôle des dommages à l’ADN, le remodelage de la chromatine au niveau des sites de cassure, ainsi que le choix de voie entre la recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non homologues. En stabilisant les foyers de dommages et en propageant des cascades de signalisation dépendantes de l’ubiquitine, MDC1 contribue au maintien de l’intégrité du génome lors du stress réplicatif et après une agression génotoxique. Des altérations de la fonction ou de l’expression de MDC1 ont été associées à des phénotypes d’instabilité génomique pertinents en cancérologie ainsi qu’à des défauts héréditaires des réseaux de réponse aux dommages de l’ADN.

MDC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MDC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MDC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MDC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MDC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MDC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MDC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MDC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MDC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MDC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.