MDC1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405652-ACT

Mediator of DNA Damage Checkpoint 1 (MDC1) è una proteina nucleare di impalcatura che amplifica la segnalazione delle rotture a doppio filamento del DNA legandosi a H2AX fosforilata (γH2AX) e coordinando il reclutamento di fattori di riparo e di checkpoint. Attraverso interazioni che supportano la segnalazione dipendente da ATM, MDC1 promuove l’attivazione del checkpoint del danno al DNA, il rimodellamento della cromatina nei siti di rottura e la scelta della via tra ricombinazione omologa e giunzione delle estremità non omologhe. Stabilizzando i foci di danno e propagando cascate di segnalazione ubiquitina-dipendenti, MDC1 contribuisce all’integrità del genoma durante lo stress replicativo e dopo un insulto genotossico. Alterazioni della funzione o dell’espressione di MDC1 sono state associate a fenotipi di instabilità genomica rilevanti per la biologia del cancro e per difetti ereditari nelle reti di risposta al danno del DNA.

MDC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MDC1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MDC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MDC1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MDC1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MDC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MDC1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MDC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MDC1 nelle cellule tumorali con espressione di MDC1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.