MCM2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421591-ACT

Mcm2 kodiert die MCM2-Untereinheit des Minichromosomen-Erhaltungs-(MCM2–7)-Helikasekomplexes, einer essenziellen Komponente der eukaryotischen DNA-Replikationslizenzierungsmaschinerie. MCM2 ist an der Assemblierung des Prä-Replikationskomplexes an Replikationsursprüngen beteiligt und unterstützt den S‑Phasen-Verlauf, indem es in Koordination mit CDC45 und dem GINS-Komplex das „Origin Firing“ sowie das Entwinden der Replikationsgabel ermöglicht. Eine strenge Regulation der MCM2-Menge und seiner Beladung auf Chromatin ist mit Replikationsstress-Antworten, ATR/CHK1-Signalgebung und der Aufrechterhaltung der Genomstabilität verknüpft. Eine Fehlregulation der MCM2-Aktivität oder -Expression ist häufig mit hyperproliferativen Zuständen und chromosomaler Instabilität assoziiert, weshalb MCM2 in Studien zur Zellzykluskontrolle und DNA-Schadensantwort широко als Marker und mechanistischer Knotenpunkt genutzt wird.

MCM2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Mcm2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MCM2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Mcm2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Mcm2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MCM2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Mcm2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MCM2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MCM2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Mcm2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.