MBD4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403156-ACT

Humanes MBD4 (Methyl-CpG-Bindungsdomänenprotein 4) ist eine DNA-Glykosylase, die T:G- und U:G-Fehlpaarungen erkennt, die durch Desaminierung an methylierten CpG-Stellen entstehen, und die Basenexzisionsreparatur initiiert, um die Genomintegrität zu erhalten. Indem MBD4 die Erkennung von Methyl-CpG mit der Exzision der Läsion koppelt, verknüpft es den epigenetischen Kontext mit der DNA-Reparatur und trägt zur Unterdrückung der Mutationsakkumulation an CpG-Dinukleotiden bei. Die MBD4-Aktivität überschneidet sich mit replikationsassoziierten Reparatur- und Schadensantwortprozessen, die Mutationsspektren und chromosomale Stabilität prägen. Eine veränderte MBD4-Funktion oder -Expression wurde mit Hypermutationsphänotypen und genomischer Instabilität in verschiedenen krebsrelevanten Kontexten in Verbindung gebracht, was seine Eignung für die Untersuchung von Mechanismen der Mutagenese unterstreicht.

MBD4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBD4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MBD4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBD4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBD4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MBD4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBD4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MBD4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MBD4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBD4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.