MBD4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403156-ACT

A MBD4 humana (proteína 4 do domínio de ligação a metil-CpG) é uma DNA glicosilase que reconhece incompatibilidades T:G e U:G decorrentes da desaminação em sítios CpG metilados e inicia o reparo por excisão de base para manter a integridade do genoma. Ao acoplar o reconhecimento de metil-CpG à excisão da lesão, a MBD4 conecta o contexto epigenético ao reparo do DNA e contribui para suprimir o acúmulo de mutações em dinucleotídeos CpG. A atividade da MBD4 se cruza com processos de reparo associados à replicação e de resposta a danos que moldam os espectros mutacionais e a estabilidade cromossômica. Alterações na função ou na expressão de MBD4 têm sido associadas a fenótipos de hipermutação e instabilidade genômica observados em diversos contextos relevantes para o câncer, sustentando sua utilidade no estudo de mecanismos de mutagênese.

MBD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MBD4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MBD4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MBD4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MBD4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MBD4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MBD4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MBD4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MBD4 em células tumorais com expressão de MBD4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.