Plasmide CRISPR d'Activation (h) MaxiKα: sc-402208-ACT

KCNMA1 code la sous-unité α du canal MaxiKα (BK), un canal potassique K+ de grande conductance, activé par le Ca2+ et le voltage, qui intègre les signaux intracellulaires de Ca2+ avec la dépolarisation membranaire afin de réguler l’excitabilité cellulaire. En modulant la repolarisation du potentiel d’action et en contrôlant l’hyperpolarisation post-décharge, MaxiKα influence la libération de neurotransmetteurs, le tonus du muscle lisse, la sécrétion endocrine et la réactivité vasculaire. Le canal est fonctionnellement couplé à des microdomaines de Ca2+ et à des voies de signalisation qui ajustent les flux ioniques, le potentiel de membrane et l’homéostasie du Ca2+, notamment via des interactions avec des sous-unités auxiliaires β/γ qui modulent la cinétique d’ouverture/fermeture (gating). Une activité dérégulée de KCNMA1 a été associée à des phénotypes d’hyperexcitabilité neurologique, à des dysfonctions du muscle lisse vasculaire et des voies aériennes, ainsi qu’à des programmes de prolifération cellulaire altérés, pertinents pour la recherche en électrophysiologie et en canalopathies.

MaxiKα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNMA1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MaxiKα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNMA1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNMA1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MaxiKα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNMA1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MaxiKα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MaxiKα dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNMA1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.