Matriptase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402971-ACT

Humanes ST14 kodiert Matriptase, eine Typ-II-transmembrane Serinprotease, die die perizelluläre Proteolyse an epithelialen Oberflächen reguliert. Matriptase ist an Proteasekaskaden beteiligt, indem sie Substrate wie den Pro-Hepatocyte-Growth-Factor (pro-HGF) sowie weitere extrazelluläre oder membranassoziierte Proteine aktiviert und dadurch Prozesse wie die Homöostase der epithelialen Barriere, die Zellpolarität und das Remodeling der lokalen Mikroumgebung beeinflusst. Durch die Steuerung des Extrazellulärmatrix-Umsatzes und der Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren kann die ST14-Aktivität Signalwege modulieren, die mit Proliferation, Differenzierung und Migration verknüpft sind. Eine fehlregulierte Matriptase-Expression oder -proteolytische Aktivität wird mit epithelialer Pathobiologie in Verbindung gebracht und wird häufig in der Krebsbiologie, bei Entzündungen und im Kontext von Gewebe-Remodeling untersucht.

Matriptase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ST14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Matriptase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ST14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ST14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Matriptase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ST14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Matriptase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Matriptase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ST14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.