Maspin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-416693-ACT

Das humane SERPINB5 kodiert Maspin, ein nicht-inhibitorisches Mitglied der Serpin-Familie, das an der Regulation der Adhäsion und Motilität epithelialer Zellen sowie an Interaktionen mit der extrazellulären Matrix beteiligt ist. Maspin wird mit der Modulation der Plasminogenaktivierung, der Zell–Matrix-Signalübertragung und der Zytoskelettdynamik in Verbindung gebracht und beeinflusst damit Prozesse wie Invasion, Migration und Gewebeumbau. Seine Expression und subzelluläre Lokalisation sind in vielen Tumorarten häufig verändert; dort wird Maspin als kontextabhängiger Regulator der Tumorprogression und metastasenassoziierter Phänotypen untersucht. Daher wird SERPINB5 breit eingesetzt, um Signalwege zu untersuchen, die epitheliale Differenzierung, Stressantworten und mikroumgebungsabhängige Signale in der Krebsbiologie miteinander verknüpfen.

Maspin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SERPINB5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Maspin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SERPINB5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SERPINB5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Maspin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SERPINB5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Maspin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Maspin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SERPINB5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.