MAP-1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403259-ACT

MAP1A kodiert das mikrotubuliassoziierte Protein 1A (MAP-1A), ein hochmolekulares zytoskelettales Gerüstprotein, das Mikrotubuli stabilisiert und zur Organisation der axonalen Architektur in differenzierten Neuronen beiträgt. Durch die Verknüpfung von Mikrotubuli mit aktinassoziierten Komplexen und Cargo-Adaptorproteinen unterstützt MAP-1A die Neuritenauswachsung, den intrazellulären Transport und die Aufrechterhaltung von Synapsen – Prozesse, die zentral für neuronale Polarität und Netzwerk-Konnektivität sind. Eine veränderte Regulation der Mikrotubuli-Dynamik und des axonalen Transports ist ein wiederkehrendes Merkmal der Biologie neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen, wodurch MAP1A ein relevanter Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Zytoskelett-Dysfunktion ist. Die MAP1A-Expression und das MAP-1A-abhängige zytoskelettale Remodeling werden daher häufig in Modellen der neuronalen Reifung, von Stressantworten und der Proteostase untersucht.

MAP-1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAP1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAP-1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAP1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAP1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAP-1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAP1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAP-1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAP-1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAP1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.