Plasmide CRISPR d'Activation (h) MANEA: sc-413213-ACT

MANEA (mannosidase endo-α) code une endo-α-1,2-mannosidase résidente de l’appareil de Golgi, qui raccourcit les N‑glycanes à haut mannose glucosylés au cours de la maturation des glycoprotéines. En offrant une alternative au traitement dépendant des glucosidases du réticulum endoplasmique (RE), MANEA contribue à coordonner le contrôle qualité de la N‑glycosylation et influence le repliement, le trafic et la sécrétion des protéines. Cette activité relie MANEA à l’homéostasie de la voie sécrétoire et aux réseaux de protéostasie qui façonnent la composition des récepteurs de surface cellulaire ainsi que les signaux qu’ils transmettent. Un traitement dérégulé des glycannes a été associé à une reconnaissance immunitaire altérée, à des phénotypes métaboliques, et plus largement à des états pathologiques où la maturation et le trafic des glycoprotéines sont perturbés.

MANEA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MANEA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MANEA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MANEA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MANEA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MANEA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MANEA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MANEA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MANEA dans les cellules tumorales présentant une expression de MANEA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.