MAGE-A3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402571-ACT

MAGEA3 kodiert MAGE-A3, ein Cancer-Testis-Antigen, das in adulten somatischen Geweben typischerweise stillgelegt ist, in zahlreichen malignen Erkrankungen jedoch durch epigenetische Deregulierung induzierbar wird. MAGE-A3 ist an der Regulation von Transkription und Proteostase beteiligt, indem es MAGE-Familien-Signalmodule nutzt, die die Aktivität von E3-Ubiquitin-Ligasen modulieren und so Proteinumsatz, Stressantworten und zellzyklusassoziierte Programme beeinflussen können. Seine Expression ist häufig mit veränderter Antigenpräsentation und Immunerkennungszuständen verknüpft und eignet sich daher als molekularer Readout zur Untersuchung tumorassoziierter Genregulation. Als stark linien- und krankheitsassoziierter Marker dient MAGEA3 als Modell-Lokus zur Erforschung der Chromatinregulation, transkriptionellen Reaktivierung und nachgeschalteten Umprogrammierung von Signalwegen in humanen Zellen.

MAGE-A3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MAGEA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAGE-A3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MAGEA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MAGEA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAGE-A3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MAGEA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAGE-A3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAGE-A3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MAGEA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.