mAChR M4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402318-ACT

CHRM4 kodiert den humanen muskarinischen Acetylcholinrezeptor M4 (mAChR M4), einen über Gi/o gekoppelten GPCR, der die neuronale Erregbarkeit und synaptische Transmission moduliert, indem er die Adenylylcyclase hemmt, die cAMP-Signalübertragung reduziert und die Aktivität von Ionenkanälen reguliert. M4 ist an cholinergen Neurotransmissionswegen beteiligt und formt den Output dopaminerger Schaltkreise durch präsynaptische und postsynaptische Signalmechanismen. Zu den nachgeschalteten Effekten zählen die Modulation der MAPK/ERK-Signalübertragung, der Calciumdynamik und der Neurotransmitterfreisetzung, wodurch die CHRM4-Aktivität mit der netzwerkweiten Kontrolle motorischer und kognitiver Prozesse verknüpft ist. Veränderte muskarinische Rezeptorsignalgebung und eine mit CHRM4 assoziierte Fehlregulation neuronaler Schaltkreise wurden in der Forschung zu neuropsychiatrischen Erkrankungen und Bewegungsstörungen untersucht, auch in Kontexten mit Relevanz für Schizophrenie, parkinsonsche Schaltkreise und substanzkonsumbezogene Phänotypen.

mAChR M4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHRM4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

mAChR M4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHRM4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHRM4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen mAChR M4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHRM4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von mAChR M4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des mAChR M4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHRM4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.