LRWD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405341-ACT

LRWD1 (leucine-rich repeats and WD repeat domain containing 1), também conhecido como ORCA, é um fator associado à cromatina implicado no licenciamento da replicação do DNA por meio de interações com componentes do reconhecimento de origens e do complexo de pré-replicação. Ele contribui para o disparo adequado das origens e para a progressão pela fase S ao favorecer o carregamento e a estabilização de fatores de replicação nas origens de replicação, conectando o estado da cromatina à duplicação do genoma. O LRWD1 também tem sido associado à organização da heterocromatina e à manutenção da estabilidade genômica, processos que influenciam o controle do ciclo celular e as respostas ao estresse replicativo. Alterações na expressão ou na função de LRWD1 foram relatadas em contextos de desregulação proliferativa, tornando-o relevante para estudos de tempo de replicação, regulação da cromatina e biologia de doenças associadas à instabilidade genômica.

LRWD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LRWD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

LRWD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LRWD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LRWD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de LRWD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LRWD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de LRWD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via LRWD1 em células tumorais com expressão de LRWD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.