Plasmide CRISPR d'Activation (h) LRWD1: sc-405341-ACT

LRWD1 (leucine-rich repeats and WD repeat domain containing 1), également connu sous le nom d’ORCA, est un facteur associé à la chromatine impliqué dans l’octroi de licence de la réplication de l’ADN via des interactions avec des composants du complexe de reconnaissance des origines et du complexe de pré-réplication. Il contribue au bon déclenchement des origines et à la progression de la phase S en favorisant le chargement et la stabilisation des facteurs de réplication au niveau des origines de réplication, reliant l’état de la chromatine à la duplication du génome. LRWD1 a également été associé à l’organisation de l’hétérochromatine et au maintien de la stabilité génomique, des processus qui influencent le contrôle du cycle cellulaire et les réponses au stress réplicatif. Une expression ou une fonction altérée de LRWD1 a été rapportée dans des contextes de dérégulation proliférative, ce qui en fait une cible pertinente pour les études sur le timing de réplication, la régulation de la chromatine et la biologie des maladies associées à l’instabilité génomique.

LRWD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LRWD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LRWD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LRWD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LRWD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LRWD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LRWD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LRWD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LRWD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de LRWD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.