LRRK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404736-ACT

Humanes LRRK1 (leucinreiches Repeat-Serin/Threonin-Proteinkinase 1) ist eine Multidomänen-Kinase, die durch Phosphorylierung nachgeschalteter Effektoren an der Organisation des Zytoskeletts, dem vesikulären Transport und der rezeptorabhängigen Signalübertragung beteiligt ist. Es wirkt an Signalwegen mit, die endosomale Dynamik, Mikrotubuli-Stabilität und Zellmotilität koordinieren; zudem wurden Funktionen in Immunzellen und in der Knochenhomöostase beschrieben. Aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit zu LRRK2 und seiner kinasegetriebenen Kontrolle von Transportprozessen wird LRRK1 im Kontext der Neurobiologie, inflammatorischer Signalwege und skelettaler Phänotypen untersucht. Eine dysregulierte LRRK1-Aktivität wurde mit veränderter Osteoklastenbiologie sowie mit einem Umbau von Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, der für degenerative und entzündliche Krankheitsmechanismen relevant ist.

LRRK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LRRK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LRRK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LRRK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LRRK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LRRK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LRRK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LRRK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LRRK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LRRK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.