LPAAT-β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405045-ACT

AGPAT2 kodiert die Lysophosphatidsäure-Acyltransferase Beta (LPAAT-β), ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das die Acylierung von Lysophosphatidsäure katalysiert und dabei Phosphatidsäure bildet – ein zentrales Zwischenprodukt der Biosynthese von Glycerophospholipiden und Triacylglycerolen. Durch die Steuerung der Verfügbarkeit von Phosphatidsäure beeinflusst LPAAT-β die Membranbiogenese, die Bildung von Lipidtröpfchen sowie lipidvermittelte Signalprozesse, die mit metabolischem Stress und der Homöostase von Organellen verknüpft sind. Die AGPAT2-Aktivität ist eng an die Lipidspeicherung in Adipozyten und die systemische Energiebilanz gekoppelt; Loss-of-function-Varianten sind mit der kongenitalen generalisierten Lipodystrophie und schwerer metabolischer Dysregulation assoziiert. Diese Eigenschaften machen AGPAT2 zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung von Lipid-Remodeling, Adipogenese und krankheitsassoziierten Störungen im Phospholipidstoffwechsel.

LPAAT-β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AGPAT2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LPAAT-β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AGPAT2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AGPAT2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LPAAT-β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AGPAT2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LPAAT-β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LPAAT-β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AGPAT2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.