LIS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402193-ACT

Das humane Gen **PAFAH1B1** kodiert **LIS1**, ein Dynein-Regulationsprotein, das für mikrotubulusbasierten Transport, die Orientierung der mitotischen Spindel und die Kernmigration während der Neuroentwicklung essenziell ist. LIS1 koordiniert die Aktivität von zytoplasmatischem Dynein und Dynactin, um die Proliferation neuronaler Vorläuferzellen, die neuronale Migration und eine korrekte kortikale Schichtung zu unterstützen. Über diese Prozesse beeinflusst PAFAH1B1 die Organisation des Zytoskeletts, die Funktion des Zentrosoms sowie Trafficking‑Wege, die Zellpolarität und Gewebearchitektur prägen. Eine Störung oder veränderte Dosierung von PAFAH1B1 ist stark mit Erkrankungen aus dem Lissenzephalie-Spektrum und anderen neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen assoziiert, wodurch LIS1 ein zentrales Ziel für mechanistische Studien der Kortexentwicklung und Dynein-getriebener Dynamik darstellt.

LIS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PAFAH1B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LIS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PAFAH1B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PAFAH1B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LIS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PAFAH1B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LIS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LIS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PAFAH1B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.