LIGHT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403128-ACT

Human TNFSF14 kodiert LIGHT, ein Typ‑II‑Membranprotein der TNF‑Superfamilie, das als immunmodulatorischer Ligand für HVEM (TNFRSF14) und LTβR (LTBR) fungiert. Die LIGHT-Signalgebung reguliert die Aktivität der NF‑κB‑ und MAPK‑Signalwege und steuert so die Kostimulation von T‑Zellen, die „Lizenzierung“ dendritischer Zellen sowie Programme inflammatorischer Zytokine; zugleich beeinflusst sie die Organisation lymphoider Gewebe und vaskuläre/stromale Antworten. Eine fehlregulierte TNFSF14-Expression wurde mit chronischen Entzündungszuständen und immunvermittelter Pathologie in Verbindung gebracht und wird häufig im Kontext von Tumor‑Immun‑Interaktionen und Gewebeumbau untersucht. Daher wird LIGHT breit als mechanistischer Ansatz genutzt, um Signalgebung an der immunologischen Synapse, Leukozytenmigration und mikroumgebungsabhängige Signale zu untersuchen, die die adaptive Immunität koordinieren.

LIGHT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TNFSF14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LIGHT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TNFSF14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TNFSF14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LIGHT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TNFSF14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LIGHT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LIGHT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TNFSF14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.