leupaxin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405101-ACT

LPXN kodiert Leupaxin, ein Adapterprotein der Paxillin-Familie, das in Fokalkontakten angereichert ist und dort integrinabhängige Signalübertragung mit dem Umbau des Aktinzytoskeletts koordiniert. Durch Interaktionen mit Kinasen und Gerüstproteinen trägt Leupaxin zu Zelladhäsion, Migration und Mechanotransduktion bei, die das Wahrnehmen der extrazellulären Matrix sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme prägen. Die LPXN-Aktivität überschneidet sich mit Fokalkontakt- und Rho-GTPase-gekoppelten Signalwegen, die die Zellbeweglichkeit und invasives Verhalten regulieren. Eine fehlregulierte Expression oder Signalgebung unter Beteiligung von Leupaxin wurde in mehreren Tumorkontexten und in funktionellen Zuständen von Immunzellen beschrieben, was seine Nutzung als mechanistischer Knotenpunkt in Studien zu metastaseassoziierten Phänotypen und adhesionsgetriebener Signalübertragung stützt.

leupaxin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LPXN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

leupaxin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LPXN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LPXN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen leupaxin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LPXN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von leupaxin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des leupaxin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LPXN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.