LARGE2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414150-ACT

Das humane Gen **LARGE2** kodiert eine bifunktionale Glykosyltransferase, die zur posttranslationalen Glykosylierung von **α‑Dystroglykan** beiträgt und so die Bildung von funktionell glykosyliertem **Matriglykan** unterstützt, das für die Bindung an die extrazelluläre Matrix erforderlich ist. Über seine Rolle im Netzwerk der Dystroglykan‑Glykosylierung hilft LARGE2, Zell‑Matrix‑Adhäsion, Membranstabilität und die Gewebearchitektur zu regulieren, insbesondere im Kontext von Muskel und Nervensystem. Störungen der α‑Dystroglykan‑Glykosylierung sind zentral für Dystroglykanopathien und verwandte neuromuskuläre Krankheitsmechanismen; zudem kann eine veränderte Glykosylierung in krankheitsrelevanten Modellen Zellmigration und Signalübertragung modulieren. LARGE2 wird daher häufig in Signalwegen untersucht, die die Reifung von Glykoproteinen, Interaktionen mit der Basalmembran und die Proteostase innerhalb des sekretorischen Weges steuern.

LARGE2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LARGE2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LARGE2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LARGE2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LARGE2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LARGE2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LARGE2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LARGE2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LARGE2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LARGE2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.