Lamin A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400039-ACT

LMNA kodiert Lamin A, ein Intermediärfilamentprotein vom Typ V, das zusammen mit Lamin C polymerisiert, um die Kernlamina zu bilden und die Integrität der Kernhülle zu gewährleisten. Lamin A reguliert die Chromatinorganisation, die Genomstabilität und die Mechanotransduktion, indem es über den LINC-Komplex das Nukleoskelett mit dem Zytoskelett koppelt und dadurch Transkriptionsprogramme sowie DNA-Schadensantworten beeinflusst. Es ist in Prozesse wie die Funktion der Kernporen, den Wiederaufbau des Zellkerns nach der Mitose und die Positionierung lamina-assoziierter Domänen (LADs) eingebunden, die zusammen das Zellschicksal und Stress-Signalwege mitprägen. Eine Fehlregulation von LMNA wird mit Laminopathien in Verbindung gebracht, die Muskel-, Fett- und Herzgewebe betreffen; zudem wird es häufig im Kontext vorzeitiger Alterungsphänotypen, Defekten der Kernmorphologie und veränderter Genexpression untersucht.

Lamin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LMNA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Lamin A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LMNA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LMNA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Lamin A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LMNA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Lamin A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Lamin A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LMNA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.