Plásmido CRISPR de Activación (h) Lamellipodin: sc-403034-ACT

RAPH1 codifica lamellipodina, un adaptador asociado a Ena/VASP y a la actina que acopla la señalización por fosfoinosítidos con la remodelación del citoesqueleto en lamelipodios y ondulaciones de membrana. Al interactuar con membranas enriquecidas en PI(3,4)P2/PI(3,4,5)P3 y con reguladores de la actina, lamellipodina favorece la dinámica de protrusión impulsada por Rac, la extensión celular y la migración direccional, conectándose con vías que coordinan el recambio de adhesiones y la endocitosis. La expresión alterada de RAPH1 o los programas de motilidad dependientes de lamellipodina se han asociado con fenotipos invasivos y con una remodelación tisular desregulada en contextos relevantes para la enfermedad, lo que la convierte en un nodo útil para estudiar redes de señalización centradas en la migración en células humanas. Estas funciones se investigan con frecuencia en modelos de diseminación de células cancerosas, procesos del neurodesarrollo y tráfico de células inmunitarias, sin implicar resultados clínicos.

Lamellipodin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RAPH1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Lamellipodin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RAPH1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RAPH1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Lamellipodin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RAPH1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Lamellipodin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Lamellipodin en células tumorales con expresión de RAPH1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.