L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m): sc-419409
- Zielspezies: mouse
- 20 µg transfektionsfertige, aufgereinigte Plasmid DNA; geeignet für 20 Transfektionen
- L-type Ca++ CP β1b Das CRISPR/Cas9-Knockout (KO)-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes für die Cas9-Nuklease und eine zielspezifische 20-nt-Guide-RNA (gRNA) kodiert, die für maximale Knockout-Effizienz unter Verwendung von Sequenzen aus der GeCKO v2-Bibliothek entwickelt wurde
- gRNA-Sequenzen lenken Cas9 so, dass es ortsspezifische Doppelstrangbrüche (DSBs) im L-type Ca++ CP β1b-Genomlokus induziert, was zu einem Gen-Knockout durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) führt
- L-type Ca++ CP β1b HDR-Plasmid (m) (sc-419409-HDR) wird für die Co-Transfektion mit dem L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) empfohlen, um die Selektion erfolgreich editierter Zellen durch HDR-vermittelte Integration einer Puromycin-Resistenzkassette und eines RFP-Reportergens zu ermöglichen
- Das L-type Ca++ CP β1b HDR-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, von denen jedes eine HDR-Matrize (Homology-Directed Repair) enthält, die den gRNA-Zielstellen im L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) entspricht
- Jedes HDR-Plasmid enthält zwei ~800 bp lange Homologiearme, die die Puromycin-Resistenz- und RFP-Kassetten flankieren und so konzipiert sind, dass sie an genomische DNA-Sequenzen binden, die die durch Cas9 induzierte Doppelstrangbruchstelle umgeben, und eine präzise HDR-vermittelte Integration ermöglichen
- Die Puromycin-Resistenz- und RFP-Gene werden von LoxP-Stellen flankiert, was die Entfernung der Selektionsmarker mittels Cre-Rekombinase (Cre-Vektor: sc-418923) nach der Etablierung stabiler Knockout-Zelllinien ermöglicht
Bestellinformation
| Produkt | Katalog # | EINHEIT | Preis | ANZAHL | Favoriten | |
L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9 KO Plasmid (m) | sc-419409 | 20 µg | $397.00 | |||
L-type Ca++ CP β1b HDR Plasmid (m) | sc-419409-HDR | 20 µg | $445.00 |
Übersicht
Cacnb1 kodiert die β1b‑Hilfsuntereinheit von L‑Typ‑spannungsabhängigen Calciumkanälen, ein zytosolisches Protein, das an die porenbildenden CaV‑α1‑Untereinheiten bindet, um den Transport der Kanäle zur Plasmamembran zu fördern und Spannungsabhängigkeit, Inaktivierungskinetik sowie Stromamplitude zu modulieren. Durch die Steuerung der Reiz‑Sekretions‑Kopplung und des aktivitätsabhängigen Ca2+-Signalings beeinflusst β1b nachgeschaltete Signalwege, darunter Ca2+/Calmodulin, Calcineurin–NFAT und CaMK‑gesteuerte Transkriptionsprogramme. In Mausgeweben tragen CACNB1‑haltige Kanalkomplexe zur Physiologie erregbarer Zellen in Muskel‑ und neuronalen Kontexten bei, wobei eine veränderte Kanalassemblierung oder ‑Gating die Calciumhomöostase stören kann. Die Störung regulatorischer Untereinheiten von L‑Typ‑Kanälen ist breit relevant für Modelle channelopathie‑ähnlicher Phänotypen, einschließlich neuromuskulärer und neuroentwicklungsbezogener Prozesse, sowie für Studien zur calciumabhängigen Signalübertragung in krankheitsassoziierten zellulären Stressantworten.
L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m) ist ein Pool von Plasmiden, die für die gezielte Disruption des Cacnb1-Gens in mouse-Zelllinien entwickelt wurden. Jedes Plasmid im Pool koexprimiert eine einzigartige sgRNA, die auf eine bestimmte Stelle innerhalb des Cacnb1-Lokus abzielt, zusammen mit der Streptococcus pyogenes Cas9-Nuklease, und kodiert für GFP, um die fluoreszente Identifizierung und Anreicherung erfolgreich transfizierter Zellen zu ermöglichen. Diese Multi-Guide-Strategie erhöht die Wahrscheinlichkeit, Frameshifts oder Deletionen zu induzieren, die zu einem funktionellen Knockout führen, und bietet damit eine robustere Alternative zu Single-Guide-Ansätzen. An mehreren Stellen induzierte DSBs werden durch nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder, bei Verwendung mit der enthaltenen HDR-Donor-Matrize, durch homologe Reparatur (HDR) an einer definierten Zielstelle innerhalb des Lokus repariert.
Bei Verwendung in Verbindung mit dem RFP-exprimierenden HDR-Donor können GFP- und RFP-Fluoreszenz gemeinsam genutzt werden, um transfizierte von editierten Zellpopulationen zu unterscheiden, was die auf Durchflusszytometrie basierenden Sortier- und Klonauswahl-Workflows optimiert.
Homology-Directed Repair (HDR)-Donor — Puromycin-Kassette mit RFP-Reporter
Für Anwendungen, die bestätigte, selektierbare Knockout-Klone erfordern, enthält das L-type Ca++ CP β1b HDR-Plasmid (m) ein HDR-Donorkonstrukt mit einer Puromycin-Resistenzkassette (PuroR) und einem Reporter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP), flankiert von Homologiearmen, die für eine definierte Cacnb1 Zielstelle spezifisch sind.
Bei Co-Transfektion mit dem L-type Ca++ CP β1b CRISPR/Cas9-KO-Plasmid (m):
- Die PuroR-RFP-Kassette integriert sich über HDR an der Cas9-Schnittstelle und unterbricht dabei das Cacnb1 offene Lesegerüst.
Die RFP-Fluoreszenz liefert einen unmittelbaren visuellen Hinweis auf eine erfolgreiche Integration und ermöglicht die fluoreszenzbasierte Identifizierung oder Sortierung editierter Zellen vor oder parallel zur Puromycin-Selektion.
Erfolgreich editierte Zellen werden durch Puromycin-Resistenz bestätigt, was den Aufwand für das Klon-Screening erheblich reduziert.
Diese Selektionsstrategie eignet sich ideal zur Erzeugung stabiler, klonaler KO-Zelllinien für nachgelagerte Funktionsstudien, Wirkstoffscreenings oder die Modellentwicklung.
Cre-lox-Kassetten-Entfernungssystem
Das HDR-Donorkonstrukt verfügt über loxP-Stellen, die die PuroR-RFP-Selektionskassette flankieren, um eine saubere Markerentfernung nach der Klonbestätigung zu ermöglichen. Die transiente Expression der Cre-Rekombinase über das enthaltene Cre-Vektor: sc-418923 schneidet die Kassette heraus, wobei eine minimale Rest-loxP-Stelle innerhalb des Cacnb1-Lokus verbleibt und potenzielle Störeffekte auf nachgeschaltete Assays eliminiert werden.
Dieser zweistufige Ansatz:
- Minimiert Störungen der lokalen Chromatinarchitektur und benachbarter regulatorischer Elemente
Stellt einen nahezu nativen genomischen Kontext am editierten Locus wieder her
Ermöglicht die Wiederverwendung der Puromycin-Selektionsstrategie in derselben Zelllinie für weitere Editierungen
Hauptmerkmale
- gRNA, die auf Cacnb1 Exon(e) abzielt, die für die L-type Ca++ CP β1b Funktion entscheidend sind
Koexpression von SpCas9 und sgRNA aus einem einzigen Plasmid für eine vereinfachte Verabreichung
HDR-Donor mit Puromycin-Resistenz für die positive Klonselektion
loxP-flankierte PuroR-Kassette mit Cre-Rekombinase-Vektor für die nahtlose Markerentfernung
Wird gebrauchsfertig für die Verabreichung durch Transfektion geliefert
Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.