Plasmide CRISPR d'Activation (m) KY peptidase: sc-421366-ACT

Le gène Ky chez la souris code la peptidase KY, une protéine enrichie dans le muscle impliquée dans l’organisation du muscle squelettique et le maintien de l’intégrité sarcomérique. La peptidase KY est associée aux processus de remodelage du cytosquelette et de protéostasie qui soutiennent la stabilité des fibres musculaires, avec des liens rapportés vers des voies régissant le développement musculaire et les réponses au stress. Une altération de la fonction de KY a été associée à des phénotypes myopathiques dans des modèles animaux, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier les mécanismes de faiblesse et de dégénérescence musculaires. En tant que cible de recherche, Ky permet d’explorer les réseaux géniques qui contrôlent la structure musculaire, la fonction neuromusculaire et des programmes transcriptionnels spécifiques des tissus.

KY peptidase Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ky sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KY peptidase Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ky dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ky, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KY peptidase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ky natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KY peptidase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KY peptidase dans les cellules tumorales présentant une expression de Ky silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.