KV1.5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404341-ACT

KCNA5 codifica o canal de potássio humano dependente de voltagem KV1.5, uma subunidade α relacionada à família Shaker que conduz a corrente retificadora tardia ultrarrápida e ajuda a controlar a repolarização da membrana e a excitabilidade. A atividade do KV1.5 molda a duração do potencial de ação, a frequência de disparo e a sinalização acoplada ao cálcio ao ajustar o potencial de membrana em repouso e o comportamento refratário em células excitáveis e não excitáveis. Por sua contribuição para a homeostase eletrofisiológica, o KCNA5 é frequentemente estudado em vias que conectam o fluxo de íons a programas transcricionais, demanda metabólica e respostas ao estresse. A expressão ou função desregulada de KCNA5/KV1.5 tem sido associada a fenótipos de ritmo cardíaco, remodelamento do músculo liso vascular e alterações na sinalização proliferativa, reforçando sua relevância em modelos mecanísticos de canalopatias.

KV1.5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNA5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KV1.5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNA5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNA5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KV1.5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNA5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KV1.5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KV1.5 em células tumorais com expressão de KCNA5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.