KV1.3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403814-ACT

KCNA3 codifica o canal humano de potássio dependente de voltagem KV1.3, uma condutância de membrana que ajuda a determinar o potencial de membrana em repouso e a modular o disparo de potenciais de ação em células excitáveis e não excitáveis. Ao regular o efluxo de potássio, o KV1.3 influencia programas de sinalização dependentes de cálcio que controlam ativação, proliferação e produção de citocinas, conectando a homeostase iônica a respostas transcricionais a jusante. A atividade do KV1.3 se cruza com a sinalização de receptores em células imunes, a bioenergética mitocondrial e vias sensíveis ao estado redox que ajustam os limiares de ativação celular. A desregulação da expressão ou da função de KCNA3/KV1.3 tem sido implicada em inflamação mediada pelo sistema imune e em estados proliferativos alterados, sustentando sua relevância para estudos mecanísticos em imunologia e em fenótipos celulares associados a doenças.

KV1.3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de KCNA3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

KV1.3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus KCNA3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição KCNA3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de KV1.3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus KCNA3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de KV1.3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via KV1.3 em células tumorais com expressão de KCNA3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.