KIR6.1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401477-ACT

KCNJ8 kodiert die nach innen gleichrichtende Kaliumkanal-Untereinheit KIR6.1, eine zentrale Komponente ATP-sensitiver Kaliumkanäle (KATP), die den zellulären Stoffwechselzustand mit der Erregbarkeit der Zellmembran koppeln. Im Komplex mit Sulfonylharnstoffrezeptor‑Untereinheiten (ABCC8/ABCC9) reguliert KIR6.1 den Kaliumausstrom in Abhängigkeit von den intrazellulären ATP/ADP‑Verhältnissen und formt so Membranpotenzial, Calciumeinstrom und nachgeschaltete Signalwege, die den Gefäßtonus und die Kontraktilität glatter Muskulatur steuern. Diese Kanäle sind wesentlich an der metabolischen Sensorik sowie an Stressantwort‑Signalwegen in erregbaren und nicht erregbaren Geweben beteiligt und beeinflussen die mitochondriale Funktion und die zelluläre Bioenergetik. Veränderte KCNJ8/KIR6.1‑Aktivität wurde mit kardiovaskulären und erregbarkeitsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, was ihre Relevanz für Studien zu Kanalopathien und Mechanismen kardiometabolischer Erkrankungen unterstreicht.

KIR6.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCNJ8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KIR6.1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCNJ8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCNJ8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KIR6.1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCNJ8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KIR6.1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KIR6.1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCNJ8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.