Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIR3.2: sc-405031-ACT

KCNJ6 code pour la sous-unité humaine du canal potassique à rectification entrante KIR3.2 (GIRK2), un effecteur clé de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G, qui contribue à stabiliser le potentiel de membrane au repos et à atténuer l’excitabilité cellulaire. Lors de l’activation, les sous-unités Gβγ libérées par les récepteurs couplés à Gi/o favorisent l’ouverture du canal, reliant les signaux de neurotransmetteurs et de neuromodulateurs à la conductance potassique dans les neurones et d’autres cellules excitables. KIR3.2 participe à la régulation de la fréquence de décharge des potentiels d’action, de l’intégration synaptique et des oscillations des réseaux, ce qui l’associe à des voies façonnant les réponses neurophysiologiques. Une activité ou une expression dérégulée de KCNJ6 a été associée à une signalisation neuronale altérée et a été étudiée dans des contextes tels que des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, ainsi que la susceptibilité aux crises d’épilepsie.

KIR3.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNJ6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIR3.2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNJ6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNJ6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIR3.2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNJ6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIR3.2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIR3.2 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNJ6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.