Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIR3.1: sc-404965-ACT

KCNJ3 code pour la sous-unité humaine du canal potassique à rectification entrante KIR3.1 (GIRK1), un composant central des canaux Kir (GIRK) activés par les protéines G, qui couplent la signalisation des GPCR à l’hyperpolarisation de la membrane. En formant des canaux hétérotétramériques avec d’autres sous-unités GIRK, KIR3.1 contribue à réguler l’excitabilité neuronale, l’activité des cellules pacemaker et la neurotransmission inhibitrice via le contrôle de la conductance potassique. Cet axe de canal ionique s’intègre à la signalisation dépendante de l’AMPc/PKA et à la régulation en aval du calcium pour façonner les profils de décharge et la réactivité synaptique. Des altérations de l’expression de KCNJ3 ou de l’activité des canaux GIRK ont été associées à des phénotypes liés à l’électrophysiologie et font l’objet de nombreuses études dans le contexte de la régulation neurologique et du rythme cardiaque, ainsi que dans des modèles cellulaires d’excitabilité et de transduction du signal.

KIR3.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNJ3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIR3.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNJ3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNJ3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIR3.1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNJ3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIR3.1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIR3.1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNJ3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.