Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIF14: sc-408805-ACT

KIF14 code une protéine motrice de type kinésine qui se localise au fuseau mitotique et au corps intermédiaire, où elle soutient la ségrégation des chromosomes, l’organisation du fuseau et la cytocinèse. Elle coordonne le transport dépendant des microtubules et interagit avec les régulateurs du fuseau central afin d’assurer une abscission correcte et la progression du cycle cellulaire. Une expression dérégulée de KIF14 est fréquemment associée à des phénotypes prolifératifs et à une instabilité chromosomique, ce qui la relie aux voies qui gouvernent la fidélité de la mitose et le maintien du génome. Par conséquent, KIF14 est couramment étudiée dans des modèles de contrôle de la division cellulaire, d’aneuploïdie et de biologie tumorale pour comprendre comment une activité de kinésine altérée modifie l’issue de la mitose.

KIF14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KIF14 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIF14 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KIF14 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KIF14, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIF14. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KIF14 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIF14 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIF14 dans les cellules tumorales présentant une expression de KIF14 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.