KGA CRISPR Activationプラスミド (h): sc-402575-ACT

ヒトのGLSはグルタミナーゼをコードしており、その腎型グルタミナーゼ（kidney-type glutaminase）アイソフォームであるKGAは、ミトコンドリア内でグルタミンをグルタミン酸とアンモニアに変換する反応を触媒します。これはグルタミノリシスにおける重要なステップです。この反応は、TCA回路（クエン酸回路）へのアナプレロシス（中間体補充）、窒素代謝、ならびにヌクレオチド・アミノ酸・グルタチオンの生合成を支え、GLS活性をレドックス恒常性や細胞ストレス応答と結び付けます。KGAはmTORC1シグナルなどの栄養感知プログラムと統合され、MYC主導の代謝制御ともクロストークし、栄養利用可能性が変動する状況下での増殖と生存を規定します。GLS/KGAの発現や活性の破綻（ディスレギュレーション）は、がんにおける代謝リモデリングや、神経・炎症性の文脈におけるグルタミン酸恒常性の変化と関連しており、代謝依存的な表現型の機構研究における重要な結節点となっています。

KGA CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性GLSの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

KGA CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における GLS 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はGLS転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性KGAの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のGLS遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるKGA依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびGLS発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるKGA経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。