KGA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402575-ACT

Das humane Gen **GLS** kodiert die Glutaminase; dabei katalysiert die Nieren‑Typ‑Glutaminase‑Isoform **KGA** die mitochondriale Umwandlung von Glutamin zu Glutamat und Ammoniak – ein zentraler Schritt der Glutaminolyse. Diese Reaktion unterstützt die Anaplerose des Tricarbonsäurezyklus, die Stickstoffverwertung sowie die Biosynthese von Nukleotiden, Aminosäuren und Glutathion und verknüpft die GLS‑Aktivität mit dem Redoxgleichgewicht und zellulären Stressantworten. KGA ist in Nährstoff‑Sensorprogramme wie die **mTORC1**‑Signalgebung eingebunden und steht im Austausch mit der **MYC**‑getriebenen metabolischen Regulation, wodurch Proliferation und Überleben bei variabler Nährstoffverfügbarkeit geprägt werden. Eine dysregulierte GLS/KGA‑Expression oder ‑Aktivität wird mit metabolischem Remodeling bei Krebs sowie mit einer veränderten Glutamat‑Homöostase in neurologischen und entzündlichen Kontexten in Verbindung gebracht und macht GLS zu einem zentralen Knotenpunkt für mechanistische Studien zu stoffwechselabhängigen Phänotypen.

KGA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GLS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KGA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GLS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GLS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KGA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GLS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KGA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KGA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GLS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.