Ketohexokinase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403399-ACT

Das menschliche KHK-Gen kodiert die Ketohexokinase, eine in Leber und Niere besonders stark exprimierte Fruktokinase, die die Phosphorylierung von Fruktose zu Fruktose-1-phosphat katalysiert. Damit initiiert sie den Fruktosestoffwechsel und koppelt den Kohlenhydratfluss an nachgeschaltete glykolytische und lipogene Stoffwechselwege. Durch die Regulation der zellulären Verarbeitung von Nahrungsfruktose beeinflusst KHK die ATP-Nutzung, die Phosphathomöostase und die Verteilung von Metaboliten in Richtung Triglyceridsynthese sowie den harnsäuregekoppelten Purinumsatz. Eine veränderte KHK-Aktivität wurde sowohl mit angeborenen Störungen des Fruktosestoffwechsels als auch mit metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, die eine hepatische Lipidakkumulation und insulinresistenzassoziierte Signalwege umfassen. Als Knotenpunkt des fruktosegetriebenen Kohlenstoffstoffwechsels wird KHK häufig im Kontext von Nährstoffsensorik, metabolischer Umprogrammierung von Hepatozyten und Stressantworten bei hoher Fruktoseexposition untersucht.

Ketohexokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KHK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ketohexokinase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KHK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KHK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ketohexokinase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KHK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ketohexokinase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ketohexokinase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KHK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.