KCTD13 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404120-ACT

Humanes KCTD13 kodiert ein Adapterprotein mit BTB/POZ-Domäne, das CUL3-basierte E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexe zusammenbaut, um die Substrat-Ubiquitinierung und die Proteostase zu regulieren. Über die Modulation des Proteinumsatzes wurde KCTD13 mit der Kontrolle des Zellzyklusfortschritts, der Zytoskelettdynamik und von Signalwegen in Verbindung gebracht, die die neuronale Entwicklung und synaptische Funktion prägen. Veränderungen der KCTD13-Gen-Dosierung innerhalb des 16p11.2-Lokus sind mit veränderten neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen assoziiert, was KCTD13 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Gen-Dosiseffekten und Pathwaysensitivität macht. Eine fehlregulierte, ubiquitinvermittelte Regulation unter Beteiligung von Mitgliedern der KCTD-Familie ist in Modellsystemen zudem für breitere Mechanismen der zellulären Homöostase und Stressantworten relevant.

KCTD13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCTD13-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCTD13 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCTD13-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCTD13-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCTD13-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCTD13-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCTD13-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCTD13-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCTD13-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.