Plasmide CRISPR d'Activation (h) KCTD13: sc-404120-ACT

Le gène humain **KCTD13** code une protéine adaptatrice contenant un domaine **BTB/POZ**, qui assemble des complexes de ligase **E3 à ubiquitine** basés sur **CUL3** afin de réguler l’ubiquitination des substrats et la protéostase. En modulant le renouvellement des protéines, KCTD13 a été associé au contrôle de la progression du cycle cellulaire, de la dynamique du cytosquelette et de voies de signalisation qui façonnent le développement neuronal et la fonction synaptique. Des variations de dosage de KCTD13 au sein du locus **16p11.2** sont associées à des phénotypes neurodéveloppementaux altérés, ce qui en fait un nœud utile pour étudier les effets de dosage génique et la sensibilité des voies. Une dérégulation des mécanismes de régulation dépendants de l’ubiquitine impliquant des membres de la famille KCTD est également pertinente pour des mécanismes plus larges d’homéostasie cellulaire et de réponses au stress dans des systèmes modèles.

KCTD13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCTD13 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KCTD13 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCTD13 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCTD13, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KCTD13. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCTD13 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KCTD13 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KCTD13 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCTD13 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.