KANK4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414866-ACT

Humanes KANK4 (KN-Motiv- und Ankyrin-Repeat-Domänen 4) kodiert einen Zytoskelett-Adaptor, der zur Koordination von kortikalen Mikrotubuli und Aktin sowie zu Zell–Matrix-Interaktionen beiträgt. Über KN-motivabhängige Interaktionen mit Mitgliedern der Kinesin-Familie und eine durch Ankyrin-Repeats vermittelte Proteinbindung ist KANK4 mit der Dynamik fokaler Adhäsionen, Zellpolarität und gerichteter Migration verknüpft – Prozesse, die Gewebearchitektur und Mechanotransduktion prägen. KANK-Familienproteine wurden in Signalwegen untersucht, die Rho-GTPase-Signalgebung, Adhäsionsumsatz und zytoskeletales Remodeling umfassen, wodurch KANK4 für Untersuchungen zu invasivem Verhalten und veränderten Phänotypen der Zellmotilität relevant ist. Eine dysregulierte Expression oder genomische Veränderung von Regulatoren des Zytoskeletts bzw. der Adhäsion, einschließlich KANK4, wird in der Krebsbiologie und in Entwicklungskontexten, in denen Migrations- und Adhäsionsprogramme gestört sind, häufig untersucht.

KANK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KANK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KANK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KANK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KANK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KANK4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KANK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KANK4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KANK4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KANK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.