Plasmide CRISPR d'Activation (h2) ITM1: sc-405155-ACT-2

Le gène humain STT3A code la sous-unité catalytique du complexe oligosaccharyltransférase (OST), qui assure la glycosylation N co-traductionnelle des polypeptides naissants dans le réticulum endoplasmique, contribuant ainsi à la protéostasie, à la maturation des protéines membranaires et sécrétées, et au contrôle qualité du RE. Par son rôle dans la biogenèse des glycoprotéines, STT3A influence des voies telles que la dégradation associée au RE (ERAD), la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et le trafic de récepteurs et de transporteurs qui dépendent d’une installation correcte des N-glycanes. Une dérégulation de la glycosylation dépendante de STT3A a été associée à des troubles congénitaux de la glycosylation ainsi qu’à des phénotypes d’adaptation au stress observés dans des maladies prolifératives, où une maturation altérée des glycannes peut affecter la signalisation et les interactions cellule–cellule. L’édition génétique ou la perturbation de STT3A dans des modèles cellulaires humains est utile pour disséquer la fonction du complexe OST, cartographier les sites de glycosylation et les dépendances des protéines clientes, et examiner comment le stress du RE et la maturation des glycoprotéines influencent les réseaux de signalisation cellulaire.

ITM1 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de STT3A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ITM1 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus STT3A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription STT3A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ITM1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus STT3A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ITM1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ITM1 dans les cellules tumorales présentant une expression de STT3A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.