ITI-H3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404269-ACT

L’inibitore inter-alfa-tripsina catena pesante 3 (ITIH3) codifica ITI-H3, un componente proteoglicano associato alla matrice extracellulare che contribuisce alla stabilizzazione di matrici ricche di ialuronano attraverso interazioni con complessi dell’inter-alfa-inibitore. Modulando l’organizzazione della matrice pericellulare, ITI-H3 può influenzare l’adesione cellulare, la migrazione e i processi di rimodellamento tissutale rilevanti per l’infiammazione e la biologia dello stroma. Un’espressione alterata di ITIH3 è stata riportata in studi sulle dinamiche del microambiente tumorale e sulla genetica di tratti neuropsichiatrici, supportandone l’uso come marcatore dipendente dal contesto dello stato della ECM e della segnalazione cellula–matrice. Queste caratteristiche rendono ITIH3 un bersaglio utile per analizzare vie dipendenti dall’ialuronano, la regolazione delle proteine secrete e fenotipi guidati dalla matrice in modelli cellulari umani.

ITI-H3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITIH3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ITI-H3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITIH3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITIH3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ITI-H3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITIH3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ITI-H3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ITI-H3 nelle cellule tumorali con espressione di ITIH3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.