IRF3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417171-ACT

Interferon Regulatory Factor 3 (IRF3) ist ein ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktor, der als zentrale Schaltstelle der angeborenen antiviralen Immunität fungiert. Nach Erkennung zytosolischer DNA oder RNA wird IRF3 nachgeschaltet von Pattern-Recognition-Rezeptor-Signalwegen aktiviert, darunter cGAS–STING und RIG-I/MDA5–MAVS. Dabei fördert eine durch TBK1/IKKε vermittelte Phosphorylierung die Dimerisierung von IRF3, seine Translokation in den Zellkern sowie die Induktion von Typ-I-Interferonen und interferon-stimulierten Genen. IRF3 ist zudem mit der NF-κB-Signalübertragung, Apoptose und Programmen inflammatorischer Zytokine verknüpft und prägt dadurch zellintrinsische Antworten auf Pathogene und zellulären Stress. Eine fehlregulierte IRF3-Aktivität wurde mit aberranten Interferon-Signaturen in Modellen infektiöser Erkrankungen, autoinflammatorischen Phänotypen und Tumor-Immun-Interaktionen in Verbindung gebracht, was IRF3 zu einem wichtigen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Immunregulation macht.

IRF3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IRF3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IRF3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IRF3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IRF3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IRF3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IRF3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IRF3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IRF3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IRF3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.