IRAK-M Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403219-ACT

IRAK3 codifica a IRAK-M, um regulador negativo do sinalhamento imunitário inato enriquecido em células mieloides, que atenua as cascatas dos recetores Toll-like (TLR) e do recetor de IL-1 ao limitar a propagação do sinal dependente de IRAK1/IRAK4 a partir do complexo MyD88. Ao restringir a ativação a jusante de NF-κB e MAPK, a IRAK-M ajuda a moldar a produção de citocinas e quimiocinas e contribui para a tolerância à endotoxina e para a resolução das respostas inflamatórias. Alterações na expressão de IRAK3 têm sido associadas a sinalização inflamatória desregulada em macrófagos e monócitos e são frequentemente estudadas em contextos de inflamação crónica, imunossupressão e evasão imunitária induzida por patógenos. Estas propriedades tornam a IRAK-M um alvo útil para dissecar o controlo por feedback em vias da imunidade inata e programas transcricionais associados a transições de estado de células mieloides.

IRAK-M O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de IRAK3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

IRAK-M O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus IRAK3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição IRAK3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de IRAK-M. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus IRAK3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de IRAK-M no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via IRAK-M em células tumorais com expressão de IRAK3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.