IP3R-III CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402138-ACT

ITPR3 kodiert den Inositol-1,4,5-trisphosphat-Rezeptor Typ 3 (IP3R-III), einen Ca²⁺-Freisetzungskanal des endoplasmatischen Retikulums, der sich als Reaktion auf IP3 öffnet, das nachgeschaltet der Phospholipase‑C-Signalgebung gebildet wird. Durch die Formung intrazellulärer Ca²⁺-Oszillationen und der Signalgebung in Mikrodomainen reguliert IP3R-III Sekretion, epitheliale Polarität, mitochondrialen Stoffwechsel und Ca²⁺-abhängige Transkriptionsprogramme. Die Funktion von IP3R-III überschneidet sich mit GPCR- und Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegen und koppelt extrazelluläre Signale an die ER-Ca²⁺-Dynamik sowie an nachgeschaltete Effektoren wie calmodulinabhängige Kinasen und die NFAT-Signalgebung. Veränderte ITPR3-Expression oder eine gestörte Ca²⁺-Homöostase wurden in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten mit dysregulierter Proliferation, Stressantworten und epithelialem Remodeling in Verbindung gebracht, was mechanistische Studien von Ca²⁺-Signalnetzwerken unterstützt.

IP3R-III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ITPR3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IP3R-III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ITPR3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ITPR3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IP3R-III-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ITPR3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IP3R-III-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IP3R-III-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ITPR3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.