Plasmide CRISPR d'Activation (h) Int-6: sc-405759-ACT

Le gène humain EIF3E (Int-6) code une sous-unité conservée du complexe eucaryote du facteur d’initiation de la traduction 3 (eIF3), qui soutient l’initiation de la traduction dépendante de la coiffe (cap) et coordonne le recrutement des ARNm sur la sous-unité ribosomique 40S. Au-delà du contrôle de la traduction, Int-6 a été associé à la protéostasie et à la transduction du signal via des interactions qui couplent la synthèse protéique à la dynamique du système ubiquitine–protéasome et à des programmes de réponse au stress. L’activité d’EIF3E influence la progression du cycle cellulaire, la différenciation et les réponses adaptatives au stress cellulaire, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la reprogrammation traductionnelle. Une dérégulation de l’expression d’EIF3E ou de l’équilibre du complexe eIF3 a été associée à des altérations du contrôle de la croissance et à des contextes de signalisation oncogénique, ce qui motive des recherches mécanistiques en biologie du cancer et dans des pathologies apparentées.

Int-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EIF3E sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Int-6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EIF3E dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EIF3E, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Int-6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EIF3E natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Int-6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Int-6 dans les cellules tumorales présentant une expression de EIF3E silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.