INPP5E CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405923-ACT

INPP5E kodiert die Inositol-Polyphosphat-5-Phosphatase E, eine Phosphoinositid-5-Phosphatase, die PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3 hydrolysiert und dadurch die membranbasierte Lipid-Signalübertragung mitgestaltet. Das Protein ist im primären Zilium angereichert, wo es die ziliäre Phosphoinositid-Zusammensetzung, den Transport von Signalrezeptoren und nachgeschaltete Signalwege einschließlich Hedgehog sowie weiterer ziliumabhängiger Signalmodule reguliert. Über diese Funktionen trägt INPP5E zur Ziliogenese, zur neuronalen Entwicklung und zur Aufrechterhaltung der Zellpolarität bei. Eine Störung oder Fehlregulation von INPP5E wurde mit menschlichen Ziliopathien in Verbindung gebracht, was seine Bedeutung für die Untersuchung ziliumzentrierter Krankheitsmechanismen unterstreicht.

INPP5E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen INPP5E-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

INPP5E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des INPP5E-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der INPP5E-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen INPP5E-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native INPP5E-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von INPP5E-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des INPP5E-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem INPP5E-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.