Importin-7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403562-ACT

IPO7 kodiert Importin-7, einen nuklearen Transportrezeptor der Karyopherin-β-Familie, der den RanGTP-abhängigen Import von Frachtproteinen durch den Kernporenkomplex vermittelt. Importin-7 unterstützt die nukleäre Lokalisation vielfältiger Faktoren, darunter ribosomale Proteine und regulatorische Proteine, die an der Kontrolle der Transkription, der Chromatinorganisation und der Zellzyklusprogression beteiligt sind, und verknüpft damit den nukleozytoplasmatischen Transport mit Proteostase und Wachstumssignalen. Über seine Funktion im Kernimport beeinflusst IPO7 die Ribosomenbiogenese sowie Stressantwort-Programme, die in proliferativen Zuständen häufig verändert sind. Fehlregulierter nuklearer Transport und veränderte IPO7-Expression wurden mit onkogenen Signalwegen und Phänotypen der Genomstabilität in Verbindung gebracht, was IPO7 zu einem relevanten Knotenpunkt für mechanistische Studien des nuklearen Transports in menschlichen Zellen macht.

Importin-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IPO7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Importin-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IPO7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IPO7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Importin-7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IPO7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Importin-7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Importin-7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IPO7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.