IMP-1/IGF2BP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401703-ACT

IGF2BP1 (IMP-1) ist ein RNA-bindendes Protein, das N6‑Methyladenosin (m6A) sowie weitere Sequenz- und Strukturmerkmale erkennt, um während der Entwicklung und bei zellulären Stressantworten die Lokalisation, Stabilität und Translation von mRNAs zu regulieren. Durch die Modulation des Schicksals von Transkripten, die mit Wachstum und Stoffwechsel verknüpft sind, beeinflusst IGF2BP1 Programme, die Proliferation, Migration und die epithelial–mesenchymale Transition steuern, und greift über die Expression nachgeschalteter Zielgene in Signalnetzwerke wie PI3K–AKT–mTOR und MAPK ein. Eine aberrante IGF2BP1-Expression wurde in mehreren Tumorkontexten beschrieben und ist mit einer veränderten posttranskriptionellen Kontrolle onkogener und pro-survival mRNAs assoziiert. Darüber hinaus ist die IGF2BP1-abhängige RNA-Regulation für stammzellähnliche Phänotypen und die Umgestaltung des Zellzustands relevant und unterstützt mechanistische Studien zu genregulatorischen Netzwerken.

IMP-1/IGF2BP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen IGF2BP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

IMP-1/IGF2BP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des IGF2BP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der IGF2BP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen IMP-1/IGF2BP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native IGF2BP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von IMP-1/IGF2BP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des IMP-1/IGF2BP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem IGF2BP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.